組織的免疫熒光之所以難做，是因?yàn)榻M織會(huì)有自發(fā)熒光，會(huì)干擾我們的實(shí)驗(yàn)，尤其想在組織上做磷酸化的免疫熒光那更是難上加難。這次主要講組織的免疫熒光。
做組織的免疫熒光我做過(guò)的和知道的有兩種方法，一種是選用冰凍切片的組織，一種是選用石蠟包埋的組織。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)。
所以，石蠟切片的片子需要做抗原修復(fù)，需要在檸檬酸鹽緩沖液中煮30 min，這樣更有效的去除醛類固定試劑導(dǎo)致的蛋白之間的交聯(lián)，充分暴露石蠟切片樣品中的抗原表位，從而大大改善免疫熒光染色。
在正式做熒光之前，片子的準(zhǔn)備程序如下。（藍(lán)色為石蠟切片，紫色為冰凍切片）
1.4%多聚甲醛4℃固定過(guò)夜；
2.1xPBS洗一次，30min；
3.30%乙醇1小時(shí),搖床上慢搖，下同；
4.50%乙醇1小時(shí)；
5.70%乙醇1小時(shí)；
6.85%乙醇1小時(shí)；
7.95%乙醇1小時(shí)；
8.正丁醇1小時(shí)（打開65℃溫箱溶蠟）；
9.石蠟65℃中處理3小時(shí)，每隔1小時(shí)換石蠟一次，包埋。
10.切片
1.4%多聚甲醛冰上固定2小時(shí)；
2.1xPBS洗一次，5min；
3.30%蔗糖沉降2小時(shí)；
4.OCT包埋。
組織和細(xì)胞一樣有些常用的固定液。根據(jù)Bencroft的分類法，可分為四類：
Ⅰ類：醛類，甲醛，戊二醛，多聚甲醛，丙烯醛，已二醛，丙二醛等。
Ⅱ類：氧化劑類，四氧化鋨（奧酸），高錳酸鉀，重鉻酸鉀等。
Ⅲ類：蛋白變性類，甲醇，乙醇，醋酸等。
Ⅳ類：其他，氯化汞，苦味酸等。
最常使用的是甲醛和多聚甲醛，其余的也在其它病理技術(shù)方面中用到，做比如電鏡的固定劑一般用2.5%戊二醛固定。
10%甲醛：對(duì)組織滲透性強(qiáng)，固定均勻。對(duì)組織收縮少。對(duì)脂肪、神經(jīng)及髓鞘、糖等固定效果好，是最常用的固定劑。但經(jīng)酒精脫水時(shí)有較大的收縮。能保存脂肪，不能沉淀核蛋白及白蛋白，長(zhǎng)期用其固定的組織使組織變?yōu)樗嵝裕焕谌旧?，特別是細(xì)胞核的著色。經(jīng)自來(lái)水沖洗6~24小時(shí)后，可以使其酸堿中和，并減少結(jié)晶。
4%多聚甲醛：對(duì)組織穿透性好，組織收縮小，對(duì)大多數(shù)抗原物質(zhì)保存較好，特別是對(duì)脂肪和各種酶的固定效果更好。固定的時(shí)間不宜太長(zhǎng)，以24小時(shí)以內(nèi)為宜，適用于免疫組織化學(xué)染色。
我自己做的比較多的是石蠟切片的。先給大家看看我們課題組做的石蠟切片的肺組織免疫熒光。
1.先檢查切片機(jī)各部位是否已固定，刀片是否鋒利（最好用新的刀片）
2.切片時(shí)要注意速度，太快易出現(xiàn)褶皺，這里可以先將樣品置于冰上冷卻哈；
3.切片時(shí)發(fā)現(xiàn)縱向刀痕時(shí)要停止切片，清除刀片上的那些碎屑；
4.展片水溫控制在42℃左右，過(guò)高蠟片彌散，過(guò)低蠟片不能展開；
5.新?lián)Q的水需要先將水加熱到42度才能放入切片，否則水溫上升后易出現(xiàn)微小氣泡，影響貼片；
6.展片槽水位應(yīng)較高，防止玻片觸底帶起氣泡，貼附于蠟片下影響貼片；
7.展片時(shí)間要適中，過(guò)短則蠟片不能完全展開，過(guò)長(zhǎng)則蠟片彌散，不利于貼片；
8.可用普通載玻片展片；
9.切片樣品置于切片盒中敞開晾干后室溫保存一段時(shí)間，我最長(zhǎng)是兩個(gè)月。建議長(zhǎng)期保存還是放入蠟塊中。
因?yàn)樽罱鼪](méi)有做相關(guān)的實(shí)驗(yàn)，所以沒(méi)有拍圖片，下次做的時(shí)候補(bǔ)上。
10.抗原修復(fù)：將切片置于0.1mol/L且Ph=6的枸櫞酸液修復(fù)液中，微波爐中火加熱6分鐘至微微沸騰，再用中低火力維持10分鐘，停止加熱后自然冷卻20-30分鐘（直接煮沸6分鐘×4次）。
11.PBS浸洗2分鐘X2次后，加0.2%tritonX-100透膜15分鐘（如果你切片比較薄的話，也可不透膜，反正細(xì)胞已經(jīng)被切開）。但如果是做細(xì)胞膜表面的蛋白，那就不要透膜了。
12.PBS 2分鐘清洗2次。
13.用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS，滴加封閉血清（最好選用二抗同來(lái)源的血清，二抗一般來(lái)自山羊，所以可以選用山羊血清。）在濕盒中室溫封閉1h。
14.用濾紙擦去封閉液，PBS清洗兩次。
15.滴加適宜濃度的一抗置濕盒中4℃孵育過(guò)夜。
16.濾紙吸去一抗，或者回收一抗。
17.PBS 3分鐘×5次，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。
18.滴加熒光二抗室溫置濕盒中避光孵育1小時(shí)，此時(shí)可在熒光顯微鏡下迅速觀察是否染上，以確定終止時(shí)間。
19.用PBS 3分鐘×3次洗去二抗，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。
20.滴加 DAPI避光孵育15分鐘。
21.用PBS 5分鐘×2次，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。
22.用含抗熒光淬滅劑的封片，37度烘干保存。
注意事項(xiàng)：
1.樣品提前兩小時(shí)從液氮中放在-20℃平衡樣品溫度；
2.冰凍包埋OCT液于室溫呈液態(tài)，-15℃以下呈固態(tài)，如不馬上切片，保存于-80度冰箱待用；
3.載玻片應(yīng)置于室溫，若長(zhǎng)時(shí)間置于-20℃則組織將不能貼附;
4.切片：切片厚度40um，切片直接放在室溫的PBS中，OCT會(huì)自動(dòng)溶解于PBS中；
5.封閉過(guò)氧化物酶體：3%H2O2，（1mL 30%H2O2 +9ml 甲醇）；
6.PBS 5分鐘X3次；
7.高溫抗原修復(fù)：95度水浴，檸檬酸鹽（PH=6.0）修復(fù)液，6min。結(jié)束后放置20-30min使溫度降低；（此步驟可選用，有相熟的同學(xué)做的時(shí)候用了這一步，結(jié)果也挺好的）；
8.PBS 5分鐘X3次；
9.透膜，0.2%Triton 室溫20 分鐘；
10.封閉：10%山羊血清，1h；
11.一抗孵育4度過(guò)夜；
12.PBS 5分鐘X3次；
13.孵育二抗，室溫1h；
14.PBS 5分鐘X3次；
15.滴加 DAPI避光孵育15分鐘。
16.用PBS 5分鐘×2次，用濾紙擦去標(biāo)本外的PBS。
17.用含抗熒光淬滅劑的封片，37度烘干保存。